免疫荧光（IF）这么做，实验数据更出彩！

发布日期：2025-01-07 15:11    点击次数：158

  回想起来，师兄的那一本记录本上，很大一部分数据都是免疫荧光结果，各种组织、细胞，五彩斑斓、如梦如幻。真的是美到令人羡（ji）慕（du）。......那么，究竟要如何操作，才能像师兄一样，获得一系列完美的免疫荧光结果呢？今天，咱们好好的了解一下免疫荧光实验~实验原理免疫荧光 (Immunofuorescence, IF) 的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来标记目的蛋白，主要包括直接法和间接法。直接法是目的蛋白和带有荧光基团的一抗结合，间接法是目的蛋白和一抗结合，然后一抗再与带有荧光基团的二抗结合，通过荧光显微镜可观测到荧光，进而观测到目的蛋白。操作步骤01 样本处理— 细胞爬片1, 在培养板中将已爬好细胞的玻片用 PBS 浸洗 3 次 , 每次 3min.2. 在 4% 多聚甲醛或其他固定液常温固定 20min, PBS 洗三次 , 每次 3min(固定方法不一 , 具体可参考后续 “细胞固定” 部分)。3. 在 0.2% Triton X-100 室温通透 5min, PBS 洗三次 , 每次 3min。— 冰冻切片1, 冰冻切片室温平衡 10-20min。2. 在 4% 多聚甲醛常温固定 20min, PBS 洗三次 , 每次 3min3. 在 0.2% Triton X-100 室温通透 5min, PBS 洗三次 , 每次 3min.— 石蜡切片1. 脱蜡a. 在二甲-苯Ⅰ号缸中浸泡 20min；b. 在二甲-苯Ⅱ号缸中浸泡 20min；c. 在无水乙醇Ⅰ号缸中浸泡 5min；d. 在无水乙醇Ⅱ号缸中浸泡 5min；e. 在 95% 乙醇中浸泡 5min；f. 在 80% 乙醇中浸泡 5min；g. 在 60% 乙醇中浸泡 5min；h. 用去离子水浸洗 3 遍，每遍 1min。此处 I 号和 II 号缸是指不同的容器，但是内容物一致。2. 抗原修复取适量的柠檬酸钠修复液 (pH 6.0) 或 Tris-EDTA 修复液 (pH 9.0) 于烧杯中 (修复液能没过切片架即可), 盖上盖子 , 待修复液煮沸后 , 将切片放入其中 , 盖上盖子 , 继续煮沸修复液 15min。通风厨中自然冷却。02 细胞固定固定剂大体可分为两大类：有机溶剂和交联剂。有机溶剂如丙酮和乙醇能去除脂类物质使细胞脱水，把蛋白质沉淀在细胞结构上。交联剂一般通过自由氨基基团把生物分子桥连起来，形成一个相互连接的抗原网。为在细胞免疫荧光实验固定过程中最大限度地减少固定剂对抗原和细胞结构的破坏 , 使免疫荧光反应清晰可靠。根据 Proteintech 多年经验，针对不同细胞器采用的首-选固定方法见下表： 细胞结构 首-选固定剂 细胞膜 A或者B 细胞质 A或者B 细胞核 A 细胞核膜 B 细胞核仁 B 高尔基体 A 内质网 A 纤毛 A 中心体 B 纺锤体 A 溶酶体 B 线粒体 A 核糖体 B 细胞骨架 A或者B 自噬体 B 注：A：交联固定剂，多聚甲醛等；B：可溶性溶剂，丙酮、乙醇等。固定剂的选择没有通用规则，倘若没有达到预期结果，可更换另一种固定剂尝试。03 抗体孵育及荧光观察1. 将固定好的样片置于装有 PBS 的培养皿中清洗 3 次，每次 5 min。每次清洗后要用吸水纸将多余的液体吸去，再在下一培养皿中清洗，注意不要干片。2. 封闭：将样片置于干燥的培养皿内，滴加 3% BSA-PBS 将样片完全覆没放于湿盒中，室温 1h 或者 4℃过夜。3. 用吸水纸将多余 BSA-PBS 溶液吸去，注意不要干片。4. 在样片上滴加 50-100μl 稀释后的一抗（参照抗体说明书的推荐稀释比），将完全浸没于一抗的样片室温孵育 2h 或 4℃过夜。5. 用 PBS 清洗样片，洗涤 3 次，每次 5min。6. 在样片上滴加 50-100μl 标记有荧光素的稀释后的二抗（参照抗体说明书的推荐稀释比），将完全浸没于二抗的样片放于湿盒中室温孵育 1h（避光）或 4℃过夜。7. 用 PBS 清洗样片，洗涤 3 次，每次 5min。8. 在样片上滴加 50-100μl 的 DAPI-PBS（1μg/ml），完全浸没于 DAPI 的样片放于湿盒中室温孵育 5-10min（避光）。9. 用 PBS 清洗样片，洗涤 2 次，每次 5min。10. 滴加封片剂，确定样品在盖玻片与载玻片之间。11. 用荧光显微镜观察。根据不同的染料选择不同波段的激发光。疑难解析免疫荧光实验结果不理想，一般可能会出现以下三种问题：01 组织细胞无着色组织细胞无着色，一种情况是实验操作问题，包括实验操作不当、实验材料异常、抗体选择和抗体质量问题等，这些均可通过设置阳性对照以及阴性对照实验来排除。第二种情况是蛋白表达问题，同上期讲的 “WB 实验无条带” 一样，IF 实验准备阶段也需要查阅大量资料，初步确认目的蛋白的时空表达谱（包含表达量、表达部位、刺激条件等）。以 ACTA2 蛋白为例：2019 年 4 月，有客户反馈 ACTA2 抗体（货号：14395-1-AP，Proteintech）检测 c57 小鼠心肌组织无荧光反应。后经技术支持复检发现 ,ACTA2 蛋白主要表达于血管平滑肌细胞（该抗体 “Background” 中有明确提示）。 复检结果也与预期一致： 01 染色定位不对染色定位 “不对”，可能是你的预期不对。同样需要确认目的蛋白的时空表达谱。以 HIF1a 蛋白为例：首先，通过 UniProt 网站，咱们了解到 HIF1a 蛋白在正常情况下为胞浆定位，但是在缺氧条件下，会向核内转移。 随后咱们以 CoCl2（一种化学性低氧模拟剂）处理模拟低氧环境，以 HIF1a 抗体（货号：20960-1-AP，Proteintech）通过 IF 实验检测。结果发现：未处理前，HIF1a 蛋白定位于胞浆；处理后，HIF1a 蛋白在核内聚集。 其次，染色定位不对，还有可能是固定剂惹的祸。在 “蛋白 “不安分”，原来是固定剂惹得祸！” 一文中有详细介绍，在此不再赘述。01染色过浅 / 过深对于染色过浅或者过深，我们首先应该感到欣慰，毕竟初步实验结果与预期一致，接下来需要做的就只是优化实验条件了。染色过浅，可能由于 a) 封闭时间过长，b) 抗体浓度过低，c) 抗体孵育温度不当或时间过短，d) 操作过程中缓冲液残留过多，间接稀释抗体浓度；染色过深，可能由于 a) 封闭时间过短，b) 抗体浓度过高，c) 抗体孵育时间过长，d) 洗涤不充分（洗涤次数少或时间短），e) 滤光片选择不合适。针对出现的结果，咱们可以根据以上几条依次排除并优化实验条件。对于 Proteintech 出品的抗体，咱们的推荐封闭时间常温 1h 左右，4℃过夜；抗体孵育时间常温不少于 1h，4℃过夜；洗涤 3 次，每次 5min。总之，对于免疫荧光实验而言，要想实验结果漂亮，首先需要在实验前做好充足准备，了解目的蛋白详细信息，确定最合适的组织细胞材料；其次在细胞固定阶段随机应变，选择最适合的固定剂；最后在抗体孵育阶段，要合理微调孵育时间和抗体浓度，以达到最优的实验条件。